Estudo Bioquímico de  componentes do sangue

Autores: Luciano Sant’Anna de Castro e Fabio Macedo da Costa  

Orientação: Prof. Luiz Leão e Lidia Amorim                                                                    

     

Introdução

O sangue pode ser considerado como uma mistura contendo alguns componentes ditos essenciais para a nossa sobrevivência. Entre estes componentes, destacam-se as hemácias, os granulócitos, os monócitos, os linfócitos e as plaquetas, cada qual com uma respectiva função.

As hemácias, nosso principal objeto de estudo, tem um papel muito importante na respiração e possui uma estrutura celular com alguma similaridade em relação às células de vários tecidos do nosso corpo. Como veremos adiante, sua estrutura pode ser explorada para a verificação da integridade das mesmas, bem como do extravazamento de componentes essenciais como a hemoglobina.

Estudos revelam que as hemácias são constituídas por uma bicamada lipídica semi-permeável,  sustentada por um citoesqueleto protéico. A composição bioquímica da membrana do eritrócito é de cerca de 52% de proteínas, 40% de lipídeos e 8% de carboidratos, de modo que algumas destas proteínas são ditas “ ïntegrais “ e as outras são ditas “ periféricas “.

A membrana das hemácias é livremente permeável a ânions,como o Cl- e o HCO3- , mas é impermeável a cátions, como o Na+ e o K+, que por sua vez penetram na mesma via transporte ativo( Na+ para fora e K+ para dentro) via bomba de Na+/K+ . O Ca2+ também é bombeado por transporte ativo, só que por outra enzima, a Ca2+ - ATPase.

As propriedades de permeabilidade da membrana da hemácia, bem como o transporte ativo de cátions, são cruciais para evitar a hemólise coloidosmótica e controlar o volume da hemácia. A energia necessária para o transporte ativo e a manutenção dos gradientes eletroquímicos provém do ATP.

A energia celular da hemácia provém da via glicolítica anaeróbica e de 3 vias auxiliares que servem para manter a função da hemoglobina. Todos estes processos são essenciais, uma vez que a hemácia deve transportar oxigênio e manter as características físicas necessárias para a sua sobrevivência na circulação.

Noventa por cento do ATP necessário para as hemácias são gerados na glicólise, a principal via metabólica do eritrócito. Cerca de 10% do ATP da hemácia são oriundos da via Pentose-fosfato.

A via da meta-hemoglobina-redutase constitui outro importante componente do metabolismo do eritrócito. Dois sistemas de meta-hemoglobina-redutase são importantes na manutenção da hemoglobina em um estado funcional reduzido. Esta via é necessária para manter o ferro do radical heme da hemoglobina no estado funcional ferroso(Fe2+).

Na ausência dessa maquinaria enzimática, ocorre o surgimento da meta-hemoglobina, que resulta da oxidação do íon ferroso(2+) em férrico(3+). A meta-hemoglobina representa uma forma não-funcional de hemoglobina e uma perda da capacidade de transporte de oxigênio, visto que a porção meta-hemoglobina não pode ser combinada ao oxigênio. Em indivíduos saudáveis, não há mais que 1% de meta-hemoglobina nas hemácias. Isso garante a função e a sobrevida das hemácias.

Existe ainda mais um fator que influina afinidade entre o oxigênio e a hemoglobina, dentro e fora da hemácia. Foi demonstrado que o

2,3-difosfoglicerato(DPG), um fosfato orgânico encontrado na hemácia em uma proporção de 1:1 com a hemoglobina, que garante uma influência na afinidade pelo oxigênio e exercendo um papel fisiologicamente importante. Em sua ausência a hemoglobina libertaria pouco oxigênio ao passar pelos capilares. No caso, DPG exerce efeito sobre a afinidade da hemoglobina, se ligando à desoxihemoglobina, porém não à oxihemoglobina. A união do oxigênio e DPG à hemoglobina é mutuamente exclusiva. Para uma boa aproximação, a oxigenação da hemoglobina na presença de DPG pode ser representada pela seguinte equação:

          A hemoglobina representa cerca de 95% do peso seco de uma hemácia ou 33% de seu peso por volume. Ela pode ser considerada uma proteína conjugada, visto que tem como parte da estrutura um grupo prostético (não-protéico). Devido à sua estrutura de cadeia múltipla, a hemoglobina, que possui um PM de cerca de 68000, é capaz de considerável alteração alostérica quando se liga e se desprende do oxigênio. A hemoglobina normal consiste da globina (um tetrâmero de 2 pares de cadeias polipeptídicas) e quatro grupos heme, cada qual contendo um anel de protoporfirina e um íon ferroso(2+). As cadeias polipeptídicas se enovelam, de modo a dar uma forma esférica à hemoglobina. Além disso, cada grupo heme se acha numa fenda com os grupos vinila hidrofóbicos da sua estrutura porfirínica circundados por cadeias laterais hidrofóbicas de resíduos amino. As 2 cadeias laterais de propanoato do heme estão próximas dos grupos amino com carga positiva dos resíduos de lisina e de arginina.

        O ferro do grupo heme está no estado de oxidação 2+ e forma ligação coordenada com um nitrogênio do grupo imidazol da histidina da cadeia polipeptídica.

         Isto deixa livre uma valência do íon ferroso para se combinar com o oxigênio.

 

  Parte da hemoglobina oxigenada (oxihemoglobina)

      O fato de o íon ferroso(2+) se combinar com o oxigênio não é paricularmente notável; muitos outros compostos também se combinam. O que é notável na hemoglobina é que quando o grupo heme se combina com o oxigênio, o íon ferroso(2+) não se oxida a férrico(3+) facilmente. Investigações mostram que, em água, um ambiente polar e hidrofílico, compostos com grupo heme se oxidam facilmente a férrico(3+). Já num ambiente apolar e hidrofóbico, o íon ferroso é facilmente oxigenado e desoxigenado, sem alterar seu estado de oxidação.

       

  A produção normal de hemoglobina é dependente de 3 processos:

● Suprimento e liberação adequados de ferro;

● Síntese adequada de protoporfirinas(precursor do grupo heme);

● Síntese adequada de globina.

        Em adultos normais, há 4 tipos de hemoglobina:

● Hb A (em torno de 92 a 95%);

● Hb A3 (em torno de 3 a 5%);

● Hb A2 (em torno de 2 a 3%);

● Hb F (em torno de 1 a 2%).

        A principal função da hemoglobina é o transporte gasoso (oxigênio ou gás carbônico), liberação e distribuição de oxigênio para os tecidos e facilidade de excreção de gás carbônico.

        A perda da viabilidade das hemácias está associada com várias alterações bioquímicas, que incluem o aumento do pH, aumento do teor de ácido lático, diminuição no consumo de glicose, redução nos níveis de ATP e uma perda da função da hemácia, expressa como um desvio para a esquerda no caso de curva de dissociação hemoglobina-oxigênio ou aumento da afinidade hemoglobina-oxigênio.

        A viabilidade está associada aos níveis de ATP e à integridade da membrana das hemácias. Os níveis apropriados de ATP são necessários para a manutenção da(o):

● Capacidade de deformação e integridade da hemácia;

● Volume de hemácias, por manter as bombas de Na+/K+ ;

● Função da hemoglobina;

● Troca lipídica da hemácia com o plasma;

● ETC.

 

          Objetivos:

        Nosso objetivo no caso é promover um estudo sobre o sangue de um modo geral, dando ênfase à alguns componentes escolhidos pela importância no nosso metabolismo. A exploração de propriedades biológicas das hemácias, como isotonicidade, bem como de propriedades físico-químicas, como oxi-redução e densidade de alguns componentes do sangue como o ferro e a hemoglobina é de grande importância no cotidiano de um hospital e envolve técnicas simples que podem ser adaptadas facilmente à rotina de uma aula prática.

A identificação de compostos coloridos por reações redox, em associação com técnicas de colorimetria pode tornar o procedimento interesante sob o ponto de vista bioquímico, além de integrar uma série de conceitos importantes normalmente estudados individualmente, em uma única prática, fazendo um apanhado geral.

Procedimento: 

        A prática se inicia pela coleta de sangue venoso de indivíduo com boa veia. Em seguida, transfere-se o sangue lentamente pela parede de um erlenmeyer, adiciona-se uma pequena porção de pérolas de vidro, tampa-se e agita-se o mesmo por rotação lenta,de modo a formar com o fibrinogênio do sangue e as pérolas, um coágulo gelatinoso que irá se depositar no fundo do recipiente e facilitará a separação do sangue incoagulável.

        Com auxílio de uma seringa apropriada, coleta-se o sobrenadante (sangue incoagulável / desfibrinado) e transfere-se o mesmo para um vidro de boca larga graduado, limpo e seco, a fim de determinar o hematócrito (volume ocupado pelas hemácias). Este pode ser considerado como o hematócrito de referência para este sangue.

        Em seguida, pode-se aspirar cuidadosamente com auxílio de uma pipeta ou seringa plástica adequada o sangue desfibrinado e gotejar de modo lento igual número de gotas para quatro vidros de boca larga graduados, limpos e secos, contendo respectivamente água, solução hipotônica de glicose, solução isotônica (soro fisiológico a 0,9%) e por fim solução hipertônica de glicose.

        Pode-se fazer uma comparação dos volumes ocupados pelos respectivos hematócritos e avaliar a isotonicidade por esfregaço das hemácias em cada solução e visualização através de microscópio óptico de imersão. O controle físico-químico de hemocomponentes como a hemoglobina pode ser feito via reações redox (demonstradas nos desenhos esquemáticos) e método do CuSO4 (de uso muito comum  em hospitais). O ferro também pode ser identificado por reações redox cromáticas, sendo seu teor encontrado proporcional ao de hemoglobina. O teor de ferro pode ser medido por colorimetria.

 

Estudo de propriedades biológicas das hemácias...

O que aconteceria com hemácias colocadas em Solução Hipotônica?

O que aconteceria com hemácias colocadas em Solução Isotônica?

O que aconteceria com hemácias colocadas em Solução Hipertônica?

Obs: A solução hipotônica é a única em que pode ocorrer dois tipos de situações (vide opção-1 e opção-2). As soluções de hemácias em água promovem a destruição instantânea das mesmas, tornando-as inviáveis.

          A análise dos componentes no sobrenadante (após centrifugação) da solução hipotônica pode nos revelar se houve ou não hemólise. Caso tenha ocorrido, pode-se determinar o grau de viabilidade das hemácias, de acordo com o teor de ferro ou de hemoglobina medidos.

        Alguns métodos podem ser utilizados para auxiliar na análise, entre eles pode-se citar o método do CuSO4 , uma técnica baseada em densidade, ou seja, um método físico.Outras formas de análise são baseadas em reações como o método do H2O2,  uma técnica baseada na atividade catalásica, que envolve uma reação de oxi-redução, e ainda o método colorimétrico, uma técnica baseada em uma sequência de reações capazes de produzir compostos coloridos, passíveis de análise pelo uso de um fotocolorímetro. Este último método possui importantes fundamentos teóricos, e já foi muito utilizado como substitutivo de outras técnicas do passado, pela sua praticidade e facilidade para manipulação. 

   

Importância destes estudos:

    As informações e técnicas abordadas neste módulo são de grande importância para a formação do estudante de graduação. É uma chance que o aluno tem de aumentar sua gama de conhecimento e adquirir um embasamento teórico capaz de facilitar seu aprendizado em disciplinas de níveis mais complexos, dentro da área biomédica.

        Deve-se salientar a elevada importância de um estudo sobre o sangue, visto que este conhecimento pode ser utilizado na exploração de propriedades peculiares de seus constituintes. Um bom exemplo para isso é a isotonicidade, uma propriedade biológica que a hemácia possui e que auxilia muito o homem no preparo de soluções parenterais ou seja, soluções utilizadas como injetáveis para indivíduos que se encontram à beira da morte e não têm condições de se alimentar por via oral. Todavia, as soluções parenterais são elaboradas por metodologias de rigorosos controles de qualidade e devem garantir que não haja reações adversas quando administradas.

        As soluções ditas hipotônicas, jamais devem ser administradas por via endo-venosa, visto que vão gerar alterações no tônus das hemácias e podem levar à um quadro de choque anafilático, que por sua vez pode levar ao óbito. Para fazer uso destas soluções, deve-se isotonizá-las e para isso, pode-se explorar as propriedades biológicas das hemácias. Através de cálculos matemáticos, pode-se saber o quanto de agente isotonizante (NaCl) se faz necessário para tornar isotônica a solução injetável em questão.

 As soluções ditas hipertônicas, podem ser administradas por vias específicas e sempre em locais selecionados, como nádegas e braço musculoso. A administração deste tipo de solução deve ser feita de um modo lento, a fim de evitar sensação de mal-estar e calor na garganta.

A via endo-venosa pode ser utilizada, desde que em veia de grande calibre, como a sub-clávica.

        Esperamos com este trabalho, mostrar que o sangue, tão importante para o hemofílico, se mostra uma importantíssima ferramenta de trabalho, e que por isso deve ser preservada para o seu uso correto, levando-se em conta que o mesmo passa por uma série de ensaios para avaliar a  sua viabilidade e ausência de doenças. O uso incorreto do sangue, associado normalmente à má fé de seus usuários 

(exemplo: esportistas que recebem sangue para elevar seu teor interno de eritropoietina, um hormônio que induz a produção de hemácias e aumenta assim, a oxigenação dos tecidos) tende a reduzir o volume nos bancos de sangue que poderia ser usado pelos mais necessitados. 

Bibliografia