Laboratório de Patologia Celular e Molecular

Professora: Thereza Quírico dos Santos

Aluno: Ricardo dos Santos Pereira

Curso: Ciências Biológicas

 

 

Protocolo de Extração e Dosagem de Colágeno e Hidroxiprolina

 

 

Introdução

 

         O colágeno é o principal componente do tecido conjuntivo, é a proteína mais abundante do organismo e é uma das proteínas mais conservadas ao longo do processo evolutivo.

         A molécula de colágeno está disposta sob a forma de a-tripla-hélice. Os principais aminoácidos que a compõe são: Glicina, Prolina e Hidroxiprolina. O colágeno apresenta 2 aminoácidos característicos: Hidroxilisina e Hidroxiprolina. A hidroxiprolina é responsável pela estabilidade da molécula de colágeno.

 

        

Objetivo

 

         Extração total e dosagem de colágeno e hidroxiprolina.

 

 

         Material

 

q      Vidraria

 

 

q      Diversos

 

 

q      Reagentes

 

 

q      Equipamentos

 

 

 

 

 

         Metodologia

 

         Preparo da Curva Padrão de BSA

 

BSA [ 1,0 mg / mL ]

 

Diluir 7x – 1,0 mL BSA + 6,0  mL H2O ( [ 0,14 mg / mL ] )

 

 

a)     50 mL BSA + 450 mL H2O

b)    100 mL BSA + 400 mL H2O

c)     200 mL BSA + 300 mL H2O            +            2,5 mL Bradford

d)    300 mL BSA + 200 mL H2O

e)     400 mL BSA + 100 mL H2O

 

Ler D.O. 595 hm (Cubeta de plástico).

Obs.: Lavar a cubeta com álcool 70%.

 

 

Extração de Colágeno (Método de Schor Modificado, 1980)

 

 

Obs.: O volume de Ácido Acético 1,0 M vai variar de acordo com o material utilizado.

 

Dosagem de Colágeno

 

 

a)     50 mL amostra + 450 mL NaCl

b)    100 mL amostra + 400 mL NaCl

c)     200 mL amostra + 300 mL NaCl            +            2,5 mL Bradford

d)    300 mL amostra + 200 mL NaCl

e)     400 mL amostra + 100 mL NaCl

 

Ler D.O. 595 hm (Cubeta de plástico).

Obs.: Lavar a cubeta com álcool 70 %.

 

 

Preparo da Curva Padrão de Hidroxiprolina ( [ 15mg / mL ] )

 

a)     2,0 mL OH-Prolina + 198 mL H2O

b)    4,0 mL OH-Prolina + 196 mL H2O

c)     8,0 mL OH-Prolina + 192 mL H2O

d)    12 mL OH-Prolina + 188 mL H2O

e)     16 mL OH-Prolina + 184 mL H2O

 

 

Adição dos Reagentes:

 

 

Obs.: Amostras muito escuras devem ser diluídas com Isopropanol.

 

Ler D.O. 560 hm (Preferencialmente cubeta de vidro, mas pode ser de plástico).

Obs.: Lavar a cubeta com HCl 10%.

 

 

Extração de Hidroxiprolina (Método de Berg, 1982)

 

 

 

Dosagem de Hidroxiprolina

 

 

a)     10 mL amostra + 190 mL H2O

b)    20 mL amostra + 180 mL H2O

c)     50 mL amostra + 150 mL H2O            +            adição dos reagentes

d)    100 mL amostra + 100 mL H2O

e)     200 mL amostra + 0 mL H2O

 

Obs.: Os reagentes e os procedimentos utilizados são os mesmos do preparo da curva padrão de OH-prolina.

 

Limitações

 

O Ácido Acético utilizado só conseguiu extrair o colágeno presente nos tecidos que não apresentavam intensa fibrose, pois neste caso a extração não foi total, interferindo assim no resultado obtido.

 

 

Referências

 

Este protocolo é uma adaptação do Método de Schor modificado (1980), referente à extração ácida de colágeno e do Método de Berg (1982), para a extração ácida de hidroxiprolina.

 

 

Observações

 

O método de Bradford é ideal para a dosagem de colágeno, pois não interfere com os resíduos de glicina da molécula presentes na amostra após extração.

 

 

 

Preparo dos Reagentes

 

 

1. Ácido Acético 1,0 M

 

r = 1050 g / L

PM = 60,05 g / mol

 

                                    M = m / mol        Þ        M =     1050     = 17, 485 M

                                                V                                  60,05 x 1

 

                                                              Ci . Vi = Cf . Vf

                                                       

                                                                   17,485 . Vi = 1 . 1000

 

                                                              Vi = 57,18 mL

 

 

2. Ácido Clorídrico 6,0 N

 

r = 1,19 kg / L

% p/p = 36

 

 

            1190g  ¾  100%

                x      ¾  36%

 

                x= 428,4g   

 

 

Eqg = mol =36,5 = 36,5 g

             x        1

 

                                    N = m / eqg        Þ        N =    428,4g     = 12 N

                                                V                                 36,5 x 1

 

 

                                                               Ci . Vi = Cf . Vf

                                                       

                                                                         12 . Vi = 6 . 1000

 

                                                                 Vi = 500 mL

 

 

 

 

3. Ácido Clorídrico 2,0 M

 

Molaridade = Normalidade

 

                                                               Ci . Vi = Cf . Vf

                                                       

                                                                         12 . Vi = 2 . 500

 

                                                                 Vi = 83,5 mL

 

 

4. Bradford

 

·       10 mg Coomassie G250;

·       5,0 mL Etanol P.A.;

·       10 mL Ácido Fosfórico P.A.

 

 

Preparo:

 

·       Dissolver o Coomasie no Etanol;

·       Colocar o Ácido Fosfórico;

·       Água q.s.p. 100 mL (Completar com H2O até 100 mL).

 

 

Obs.: Utilizar filtro de papel e filtrar até ficar marrom (Utilizar luva).

Estável por 1 mês em geladeira (Conservar em frasco escuro).

 

 

5. Cloreto de Sódio 0,15 M

 

PM = 58,5 g / mol

           

                                                        58,5 g  -  1mol

                                                            x      -  0,15 mol

 

                                                           x = 8,775 g / L

 

 

 

 

6. Hidróxido de Sódio 2,0 M

 

         P.M.= 40g / mol

 

 

                                                            40g  ¾  1 mol / L

                                                              x    ¾  2 mol /L

 

                                                                    x= 80g

 

 

                                                          V= 500 mL \x= 40g

 

 

7. Reagente A

 

 

Misturar 1 volume de Cloramina T com 4 volumes de Tampão Acetato / Citrato.

 

Obs.: Fazer 3,0 mL (600 mL de Cloramina T + 2400 mL de Tampão). Volume necessário para 12 tubos.

 

 

Cloramina T 7%

 

·       7,0 g  Cloramina T;

·       Água q.s.p. 100 mL.

 

Obs.: Estável por 3 semanas em geladeira.

 

 

Tampão Acetato / Citrato pH = 6,0

 

·       57 g  Acetato de Sódio;

·       37,5 g  Citrato de Sódio;

·       5,5 g Ácido Cítrico;

·       385 mL de Isopropanol;

·       Água q.s.p. 1L.

 

 

 

 

8. Reagente B

 

 

Misturar 3 volumes de DAB com 13 volumes de Isopropanol.

Obs.: Fazer 32 mL (6,0 mL de DAB + 26 mL de Isopropanol). Volume necessário para 12 tubos.

 

 

Dimetilaminobenzaldeído (DAB) em Ácido Perclórico 60%

 

·       20 g DAB;

·       30 mL Ácido Perclórico 60% v/v.

 

Obs.: Estável por 3 semanas em geladeira (Conservar em frasco escuro).

 

 

9. Solução de Hidroxiprolina

 

 

·       1,5 mg OH-Prolina;

·       Água q.s.p. 100 mL.

 

Obs.: Dividir em partes iguais de 1,0 mL e congelar (Desprezar cada parte após o uso).