UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

INSTITUTO BIOMÉDICO

MIP - BACTERIOLOGIA

 

 

COLORAÇÃO DE GRAM

 

 

 

MÉTODO DE COLORAÇÃO DE GRAM

 

1) Objetivos

a-    Aprender a preparar esfregaço de bactérias;

b-    Realizar a técnica de Coloração de Gram;

c-    Aprender o fundamento do método de coloração de Gram;

d-    Comparar a estrutura da parede celular das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas;

e-    Permitir a observação da morfologia bacteriana e fornecer informações a respeito do          comportamento do seu material celular diante dos corantes de Gram.

 

2) Interpretação

     O mecanismo da coloração de Gram se refere à composição da parede celular, sendo que as Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptideoglicano e ácido teicóico, e as Gram-negativas, uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos. Durante o processo de coloração, o tratamento com álcool-acetona extrai os lipídeos, daí resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativas.

    Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CVI) pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. A parede celular das bactérias gram-positivas, em virtude de sua composição diferente, torna-se desidratada durante o tratamento com álcool-acetona, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o complexo CVI não pode ser extraído.

    Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de bactérias. Nas Gram-positivas, o complexo CVI é retido na parede após tratamento pelo álcool-acetona, o que causa, provavelmente, uma diminuição do diâmetro dos poros da camada de glicopeptídeo ou peptideoglicano da parede celular. A parede das bactérias Gram-negativas permanece com porosidade suficientemente grande, mesmo depois do tratamento com álcool acetona, possibilitando a extração do complexo CV-l.

 

3)   Procedimentos:

a-   Preparar esfregaços a partir de culturas puras de Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Serratia marcescens.

b-   Corar os esfregaços pelo método de coloração de Gram.

c-   Observar ao microscópio óptico, sob imersão e identificar a morfologia deste microrganismos e sua reação frente ao método de Gram.

 

4)   Preparo do esfregaço:

a-   Pegar uma lâmina limpa no recipiente, secar e flambar rapidamente na chama do bico de Bunsen;

b-   Identificar o lado da lâmina onde será feito o esfregaço; 

c-   Flambar a alça bacteriológica deixá-la esfriar e colocar na lâmina uma gota de                solução salina fisiológica;

d-   Flambar a agulha bacteriológica, deixar esfriar próximo a chama, abrir a placa  com a cultura teste e tocar a colônia escolhida para retirada da amostra, 

e-   Esfregar o material com movimentos de rotação da alça bacteriológica, para se  obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme;

 f-   Deixar secar nas proximidades da chama;

g-     Fixar o esfregaço passando a lâmina (lado oposto ao esfregaço) 5 vezes na  chama do bico de Bunsen (rapidamente).

 

 5)   Método de Coloração de Gram:

1)   Cobrir toda a lâmina com solução cristal violeta (corante roxo), aguardar um minuto;

2)   Lavar rapidamente em água destilada;

3)   Cobrir a lâmina com solução de Iugol (mordente) por um minuto;

4)   Lavar em água destilada;

5),  Inclinar a lâmina e gotejar álcool-acetona ou álcool absoluto (cerca de 15 segundos). Lavar a lâmina rapidamente em água corrente;

6)   Cobrir com fucsina de gram e aguardar 30 segundos;

7)   Lavar a lâmina em água destilada e secar (sem esfregar);

8)   Colocar uma gota de óleo de cedro sobre a lâmina e observar em objetiva de imersão (IOOX).

 

RESULTADO:    bactérias Gram-positivas: roxo

                                           bactérias Gram-negativas: rosa/vermelho

 

 

6)   Observações:

 

 

7)   Resumo

Soluções em ordem de aplicação

Reação do aspecto das bactérias  Gram-positivas

Reação do aspecto das bactérias  Gram-negativas
Cristal violeta Coradas em violeta Coradas em violeta
Solução de Iugol Formação do complexo CV-I no interior da célula, que permanece violeta Formação do complexo CV-I no interior da célula, que permanece violeta
Álcool-acetona

Desidratação da parede

celular, diminuição da

porosidade e da

permeabilidade; o
complexo CV-I não pode sair da célula, que   permanece violeta

Extração dos lipídeos da parede celular, aumento da porosidade; o complexo CV-I é removido da célula
Fucsina ou safranina

  A célula não é afetada, permanece violeta

A célula adquire o corante, tornando-se vermelha

           

8) Bibliografia

 

Ribeiro, M. C.; Soares, M. M. S. R.; Microbiologia prática: roteiro e manual; Atheneu; 1993; 

        5-8pp.

Pelczar Jr, M. J.; Chan, E. C. S.; Krieg, N. R.; Microbiology: concepts and applications;  McGrawHill; 1993; 75-76 pp.